Le neutrophile dans la mucoviscidose : acteur majeur de l’inflammation et cible potentielle des futurs traitements ?

Etude d’un marqueur du stress oxydant au niveau pulmonaire chez des enfants CF : Glutathion-S Transférase (GST) activité-génotype liés à la précocité et la chronicité de l’infection à P. aeruginosa chez des enfants atteints de mucoviscidose.

 

 

Le neutrophile dans la mucoviscidose :

acteur majeur de l’inflammation et cible potentielle des futurs traitements ?

 

Véronique Witko-Sarsat

Inserm U845, Hôpital Necker, Paris

 

L’inflammation pulmonaire chronique qui survient très tôt dans la vie du patient est un élément clé dans la gravité de la maladie. L'étude des mécanismes de l’inflammation bronchique associée à la mucoviscidose a mis l'accent sur le rôle prépondérant du polynucléaire neutrophile dans l'entretien et plus récemment dans l'initiation de cet état d'inflammation (Cantin et al., 1995). Dans le contexte de la mucoviscidose, cette dualité fonctionnelle du polynucléaire neutrophile dans son rôle à la fois anti-infectieux et pro-inflammatoire, est au coeur du processus physiopathologique et du cycle délétère inflammation/infection où oxydants et protéases jouent un rôle majeur (Witko-Sarsat et al., 1999a) . Cependant, l'une des caractéristiques de l'inflammation pulmonaire dans la mucoviscidose est l'existence d'une inflammation chronique active des voies aériennes qui apparaît très précocement chez l'enfant et bien avant la mise en évidence d'une infection bactérienne (Khan et al., 1995) . Ainsi, l'inflammation et l'infection observées dans la mucoviscidose, revêtent des caractéristiques particulières à cette maladie selon des mécanismes qui demeurent largement inconnus posant ainsi la question de l’existence d’une relation entre déficit génétique et inflammation pulmonaire chronique (Witko-Sarsat et al., 1997). De nombreuses équipes de recherche s’interrogent sur les moyens d’étudier et de caractériser d’éventuelles anomalies de l’immunité innée dont le neutrophile est un acteur majeur (Bals et al., 1999) .

 

Dans nos travaux précédents, nous avons étudié les neutrophiles des parents d’enfants atteints de mucoviscidose, afin de tester l’hypothèse d’un défaut constitutif des neutrophiles indépendant de l’infection (Witko-Sarsat et al., 1999b). En effet, dans une étude visant à étudier les oxydants dérivés de la myéloperoxydase, nous avions mis en évidence une hyperproduction constitutive d’oxydants chlorés chez les enfants atteints de mucoviscidose mais également chez les parents, sujets hétérozygotes obligatoires pour une mutation de CFTR (Witko-Sarsat et al., 1996) . Ce résultat inattendu au départ est à rapprocher d’autres résultats obtenus dans les études sur les parents hétérozygotes CFTR. Bien que ne présentant pas d’infection chronique à Pseudomonas aeruginosa, certaines anomalies ont été observées comme une susceptibilité à l’asthme. Ainsi, nos résultats démontrant un défaut constitutif des neutrophiles dans la mucoviscidose car observé tant chez les enfants que chez les parents nous ont orientés vers l’idée d’une “prédisposition” à l’inflammation dépendante des neutrophiles dans la mucoviscidose.

 

Un aspect important de la réaction inflammatoire est sa résolution et plus particulièrement, l’apoptose ou « mort programmée » des neutrophiles via leur phagocytose par les macrophages (Fadok et al., 2001; Kantari et al., 2008) . Compte tenu du nombre important de neutrophiles qui persistent dans les voies aériennes, il est probable qu’un défaut dans le déroulement de l’apoptose soit impliqué. Il a déjà été proposé que les protéases comme l’élastase puissent cliver le récepteur à la phosphatidylserine, empêchant ainsi la phagocytose par les macrophages via ce récepteur (Vandivier et al., 2002) . De plus, dans d’autres types cellulaires, comme les cellules épithéliales, l’apoptose est diminuée en présence d’un CFTR muté, ceci étant en relation avec la concentration intracellulaire en glutathion (Jungas et al., 2002) .

 

Un des objectifs majeurs de notre projet de recherche actuel est de comprendre les mécanismes de régulation de l’apoptose du neutrophile pour pouvoir éventuellement les stimuler afin de faciliter la résolution de l’inflammation. En effet, ces mécanismes sont extrêmement mal connus chez le neutrophile car cette cellule a toujours été considérée comme une cellule ayant une si courte durée de vie, que les mécanismes moléculaires la régulant ne semblaient pas pertinents. Cette vision du neutrophile est maintenant complètement révisée et le rôle du neutrophile dans l’immunité innée et dans l’inflammation est reconsidéré car essentiel (Nathan, 2006) . Dans le neutrophile, l’analyse des gènes modulés au cours d’une réaction inflammatoire a clairement montré une modulation de gènes impliqués dans l’apoptose (Kobayashi et al., 2003) . L’étude protéomique des neutrophiles apoptotiques en comparaison avec les neutrophiles de sujets sains ont permis de mettre en évidence des nouvelles protéines jouant un rôle important dans les mécanismes de survie du neutrophile et en particulier la coronine-1A qui est une protéine associée au cytosquelette et impliquée dans la formation des phagosomes. Nous avons montré pour la première fois que 1) la coronine-1A est capable d’inhiber l’apoptose du neutrophile lorsqu’elle est surexprimée et 2) qu’elle est clivée au cours de l’apoptose du neutrophile pour que celle-ci s’effectue normalement (Moriceau et al., 2009). De façon extrêmement intéressante, les patients atteints de mucoviscidose ont une survie augmentée et une expression accrue de coronine-1A, confirmant nos résultats précédents. Il apparaît donc que les neutrophiles de patients atteints de mucoviscidose présentent une survie accrue.

La question reste entière quant aux moyens d’induire l’apoptose des polynucléaires neutrophiles sans supprimer le potentiel microbicide du neutrophile, mais le concept semble bien admis (Hallett et al 2008 ; Flemming , 2006). Il a récemment été démontré que l’induction de l’apoptose des neutrophiles par la roscovitine pouvait avoir un effet anti-inflammatoire in vivo dans des modèles d’inflammation pulmonaire (Rossi et al. 2006). Dans un modèle murin de méningite à pneumocoques, il a été confirmé que l’association des antibiotiques et de la roscovitine réduisait considérablement les dommages cérébraux démontrant ainsi l’effet positif de l’induction de l’apoptose des neutrophiles sur un modèle d’infection/inflammation (Koedel et al, 2009).

Des investigations futures sur les mécanismes de survie du neutrophile sont nécessaires et devraient nous permettre de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour diminuer le nombre de neutrophiles au site de l’inflammation dans la mucoviscidose et améliorer le pronostic vital des patients.

Références bibliographiques

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Cantin A (1995) Cystic fibrosis lung inflammation: early, sustained, and severe. Am J Respir Crit Care Med151:939-941.

Fadok VA , Bratton DL and Henson PM (2001) Phagocyte receptors for apoptotic cells: recognition, uptake, and consequences. J Clin Invest108:957-962.

Flemming A. Helping hand for halting inflammation. Nat Rev Drug Discoveries 5:896 (2006)

Hallett, J.M., A.E. Leitch, N.A. Riley, R. Duffin, C. Haslett, and A.G. Rossi. 2008. Novel pharmacological strategies for driving inflammatory cell apoptosis and enhancing the resolution of inflammation. Trends Pharmacol. Sci. 29:250–257.

Jungas T, Motta I, Duffieux F, Fanen P, Stoven V and Ojcius DM (2002) Glutathione levels and BAX activation during apoptosis due to oxidative stress in cells expressing wild-type and mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. J Biol Chem277:27912-27918.

Kantari C, Pederzoli-Ribeil M, Witko-Sarsat V. The role of neutrophils and monocytes in innate immunity. Contrib Microbiol. 2008;15:118-46. Review.

Khan TZ, Wagener JS, Bost T, Martinez J, Accurso FJ and Riches DW (1995) Early pulmonary inflammation in infants with cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med151:1075-1082.

Kobayashi SD, Voyich JM, Somerville GA, Braughton KR, Malech HL, Musser JM and DeLeo FR (2003) An apoptosis-differentiation program in human polymorphonuclear leukocytes facilitates resolution of inflammation. J Leukoc Biol73:315-322.

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Konstan MW, Hilliard KA, Norvell TM and Berger M (1994) Bronchoalveolar lavage findings in cystic fibrosis patients with stable, clinically mild lung disease suggest ongoing infection and inflammation. Am J Respir Crit Care Med150:448-454.

Moriceau, S., C. Kantari, J. Mocek, N. Davezac, J. Gabillet, I.C. Guerrera, F. Brouillard, D. Tondelier, I. Sermet-Gaudelus, C. Danel, G. Lenoir, S. Daniel, A. Edelman, and V. Witko-Sarsat. 2009. Coronin-1 is associated with neutrophil survival and is cleaved during apoptosis: Potential implication in neutrophils from cystic fibrosis patients. J. Immunol.182:7254–7263.

Nathan C (2006) Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol6:173-182.

Rossi, A.G., D.A. Sawatzky, A. Walker, C. Ward, T.A. Sheldrake, N.A. Riley, A. Caldicott, M. Martinez-Losa, T.R. Walker, R. Duffin, M. Gray, E. Crescenzi, M.C. Martin, H.J. Brady, J.S. Savill, I. Dransfield, and C. Haslett. 2006. Cyclin-dependent kinase inhibitors enhance the resolution of inflammation by promoting inflammatory cell apoptosis. Nat. Med. 12:1056–1064.

Simon, H.U. 2003. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev.

Vandivier RW, Fadok VA, Hoffmann PR, Bratton DL, Penvari C, Brown KK, Brain JD, Accurso FJ and Henson PM (2002) Elastase-mediated phosphatidylserine receptor cleavage impairs apoptotic cell clearance in cystic fibrosis and bronchiectasis. J Clin Invest109:661-670.

Witko-Sarsat V, Allen RC, Paulais M, Nguyen AT, Bessou G, Lenoir G and Descamps-Latscha B (1996) Disturbed myeloperoxidase-dependent activity of neutrophils in cystic fibrosis homozygotes and heterozygotes, and its correction by amiloride. J Immunol157:2728-2735.

Witko-Sarsat V (1997) La mucoviscidose: de la génétique à l'inflammation. Actualités Innovations Médecine37:31-36.

Witko-Sarsat V, Sermet-Gaudelus I, Lenoir G and Descamps-Latscha B (1999a) Inflammation and CFTR: might neutrophils be the key in cystic fibrosis? Mediators Inflamm8:7-11.

Witko-Sarsat V., Halbwachs-Mecarelli L., Bessou G., Sermet I., Lenoir G., Allen R.C., Descamps-Latscha B. Priming of blood neutrophils in cystic fibrosis children: Correlation between functionnal and phenotypic expression of opsonin receptors pre and post PAF-priming. J. Infect. Dis. 1999b, 179: 151-162.

 

Physiopathologie de l’inflammation dans la mucoviscidose et hypothèses intégrant anomalie génétique et immunité innée.

Le défaut génétique original est la mutation du CFTR conduisant à un défaut de l’excrétion des ions chlorure et une hyperréabsorption de sodium, ceci conduisant à un épaississement du mucus dans les voies respiratoires. Ce défaut d’épuration mucocilliaire entraîne une susceptibilité accrue aux infections, une colonisation chronique par Pseudomonas aeruginosa, un recrutement important de polynucléaires neutrophiles et une inflammation pulmonaire persistante. Une voie alternative dans ce schéma physiopathologique classique pourrait être un défaut « constitutif » dans l’immunité innée, en particulier des neutrophiles qui auraient une capacité d’activation accrue et une survie allongée. Dans tous les cas de figure, le neutrophile serait une cible potentielle pour un traitement anti-inflammatoire dans la mucoviscidose.

 

 

Etude d’un marqueur du stress oxydant au niveau pulmonaire chez des enfants CF :

Glutathion-S Transférase (GST) activité-génotype liés à la précocité et la chronicité de

l’infection à P. aeruginosa chez des enfants atteints de mucoviscidose.

 

Marie-Noëlle Feuillet-Fieux et al. 2009

 

 

Depuis plusieurs années nous avons travaillé dans le domaine du stress oxydant. Le stress oxydant résulte du déséquilibre entre la production d’agents oxydants (radicaux oxygénés libres, ROL) et la quantité d’antioxydants disponibles. La toxicité broncho-pulmonaire des ROL est bien connue. Un large spectre d’agents étiologiques, incluant différentes substances chimiques toxiques, différents oxydants, est maintenant impliqué dans différentes pathologies (asthme, mucoviscidose, etc...).

Les systèmes antioxydants ont un rôle dans la protection cellulaire en neutralisant l’effet de ces substances toxiques. Parmi les systèmes enzymatiques intracellulaires capables d’avoir des actions anti-oxydantes, nous avons fait le choix d’une superfamille d’enzymes, les glutathion transférases (GST), qui interviennent dans la phase II du métabolisme des substances toxiques en catalysant la conjugaison du glutathion (GSH) aux toxiques et carcinogènes. Les GSTs ont un rôle important dans la détoxification des ROL, des époxy, des halogénés, et des aromatiques hétérocycliques liés au tabagisme.

L’activité enzymatique des GSTs peut être fortement diminuée selon le type de mutation, faux-sens ou délétion partielle, d’un locus de ce gène conduisant à différents polymorphismes, rendant les individus plus ou moins vulnérables au développement d’une maladie pulmonaire, rénale ou hépatique ainsi qu’à un risque accru de cancer. Le gène GST a déjà été proposé comme modulateur du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator).* 1-3

 

Dans notre étude poursuivie durant 3 ans, nous nous sommes focalisés sur l’activité enzymatique GST globale et le génotype des patients, sachant qu’il existe de multiples formes de GSTM1, P1 et T1.

Population étudiée : 36 enfants CF (18 filles, 18 garçons), comparés à 9 contrôles sains (3 filles, 6 garçons), d’âge médian similaire 10 ans). En fonction de la présence (n=12), ou de l’absence d’infection au moment du prélèvement (n=24 dont 12 sont « vierges » de P. aeruginosa, et 12 autres enfants ont eu au moins une infection précoce éradiquée), 3 groupes d’enfants CF ont été considérés. L’évolution du stress oxydatif et des défenses anti-oxydantes, telles que le GSH, les vitamines E, C, et A ont été mesurés et les génotypes GST (GSTM1, GSTT1, GSTP1) identifiés.

Malgré la mise au point d’une technique performante, la mesure de l’activité GST globale semble bien suivre l’état clinique des patients (plus élevée chez les enfants présentant un bon état, très abaissée dans les états sévères), mais n’a pas de valeur prédictive de risque d’infection précoce à Pseudomonasaeruginosa. Le taux des différentes vitamines E, C et A, est semblable à celui des contrôles, résultat d’une complémentation thérapeutique efficace. Seul le GSH est significativement diminué dans le groupe CF non infecté au prélèvement comparé au groupe contrôle sain.

En revanche, nous avons montré que certains génotypes GST, (GSTP1, GSTM1, GSTT1) étaient liés à une infection sévère, précoce à P. aeruginosa. **4

Les formes mutées GSTP1 AG et GSTP1 GG sont plus fréquentes chez les enfants infectés à P. aeruginosa au prélèvement. Alors que la forme non mutée GSTP1 AA est la plus représentée chez les enfants « vierges » de P. aeruginosa et diminue de plus de la moitié chez les enfants infectés au prélèvement ou primoinfectés à P. aeruginosa.

L’allèle nul GSTM1 0/0 est le plus souvent associé au variant GSTP1 AG (67 à 100%), par rapport au groupe non muté GSTP1 AA (50-54 %)

Interaction gène-gène : Nous avons observé que l’infection chronique à P. aeruginosa était environ deux fois plus fréquente chez les patients qui associaient des polymorphismes des GSTP1 et une homozygotie F508del ou une hétérozygotie composite F508del par rapport aux porteurs de GSTP1 non mutés.

Bien qu’étant le reflet de l’état clinique et de la présence d’infection, le taux d’activité globale GST subit l’interférence de nombreuses thérapies (dont les antibiotiques). De ce fait, l’activité ne peut être considérée comme un facteur pronostic de la maladie.

En revanche les variants GSTP1 et M1 seraient des marqueurs de prédisposition accrue à l’infection pulmonaire sévère à P. aeruginosa. Il serait nécessaire d’évaluer, à une plus grande échelle, l’intérêt pronostic du génotype GST chez les nouveau-nés dépistés, vierges de P. aeruginosa et, le plus souvent asymptomatiques.

L’intérêt pour les patients CF serait de les faire bénéficier d’une intervention clinique précoce voire préventive de l’infection à P. aeruginosa, telle que la vaccination.

 

 

* 1. Proportion of the GSTM1 0/0 genotype in some Slavic populations and its correlation with cystic fibrosis and some multifactorial diseases. Baranov VS et al. Hum Genet 1996;97:516-520.

 

2. Contribution of genetic factors other than CFTR to disease severity in cystic fibrosis. Hull J, Thomson AH. Thorax 1998; 53:1018-1021.

 

3. Glutathion S-Transferase M1, M3, P1 and T1 polymorphisms and severity of lung disease in children with cystic fibrosis. Flamant C et al. Pharmacogenetics 2004;14(5):295-301.

 

** 4. Glutathion S-Transferases related to P. aeruginosa lung infection in cystic fibrosis children: preliminary study. M-N Feuillet-Fieux, T Nguyen Khoa, M-A Loriot, M Kelly, P de Villartay, I Sermet, P Verrier, J-P Bonnefont, P Beaune, G Lenoir, B Lacour. Clin Biochem 2009 ;42 :57-63.

 

Communication orale à la 30th European Cystic Fibrosis Conference, Belek – Turkey, 13-16 June 2007, abstract S16 : Glutation S-Transferase activity-genotype association with time and severity o Pseudomonas aeruginosa lung infection in cystic fibrosis children. M-N Feuillet-Fieux, T Nguyen-Khoa, M Kebede, M-A Loriot, P Verrier, P de Villartay, P Beaune, G Lenoir, B Lacour.

 

Abstract aux 4 ème Assises de Génétique Humaine et Médicale 17-19 janvier 2008 – Lille. Glutathion-S Transférase (GST) activité-génotype liés à la précocité et la chronicité de l’infection à P. aeruginosa chez des enfants atteints de mucoviscidose. M-N. Feuillet-Fieux, T. Nguyen Khoa, M-A. Loriot, M. Kelly, P. de Villartay, I. Sermet, P. Verrier, J-P. Bonnefont, P. Beaune, G. Lenoir, B. Lacour.