Développement et validation clinique d’une méthode de Diagnostic Prénatal non invasif (DPN-NI) de la Mucoviscidose .

Pr Patrizia Paterlini-Bréchot

 

Nous avons développé une stratégie qui permet l’isolement très sensible (par ISET : Isolation by Size of Epithelial Tumor/Trophoblastic cells) et l’identification génétique des cellules foetales trophoblastiques circulantes (CFTC). Cette approche nous permet de cibler le diagnostic prénatal (DPN) uniquement aux cellules avec ADN foetal. Ces résultats ont ouvert de nouvelles perspectives pour le DPN-NI (Diagnostic Prénatal Non invasif) des maladies génétiques.

Cellule foetale circulante (CFTC)

 

Développement et validation clinique du test ISET pour le diagnostic prénatal de la Mucoviscidose

 La Mucoviscidose est une maladie génétique dont la fréquence est d’environ 1/3000

naissances (incidence des porteurs hétérozygotes : 1.20 à 1.40, selon l’origine géographique).

Cette maladie est due à une mutation du gène CFTR (Régulateur de Conductibilité

Transmembranaire de la Mucoviscidose) codant pour un canal chlore. D’un point de vue clinique, elle est caractérisée par des anomalies de la sécrétion de la glande exocrine, qui provoquent un risque d’obstruction ductale in utero, un dysfonctionnement du pancréas, une maladie pulmonaire obstructive chronique et des infections respiratoires à répétition. On connaît plus de mille mutations différentes du gène CFTR, dont la mutation plus fréquente, appelée F508del, est responsable de 68% des mutations impliquées dans la Mucoviscidose et consiste en une délétion de 3 bases (CTT). Notre équipe a récemment développé la méthode ISET pour le diagnostic prénatal non invasif de la Mucoviscidose.

Cette méthode a été appliquée à 12 mères à risque d’avoir un enfant atteint de Mucoviscidose.

L’analyse de seulement 3 ml de sang maternel et d’au moins deux cellules foetales par échantillon sanguin prélevé à la 11ème - 12è SA avant la biopsie des villosités choriales, a permis d’identifier, lors d’une étude effectuée en aveugle, la mère ayant un enfant malade, les cinq mères ayant un enfant porteur de l’allèle F508del et les six mères ayant des enfants non malades. Parmi ces 12 mères, 10 étaient des couples où les deux parents étaient porteurs de l’allèle F508del. Dans un couple, le père était porteur de l’allèle F508del et la mère d’une mutation inconnue, tandis que dans un autre couple, les deux parents étaient porteurs d’une mutation inconnue. Dans les deux cas, cependant, le Laboratoire de Génétique Médicale (Hôpital Necker) disposait de l’ADN d’un enfant malade des mêmes familles (cas index), ce qui a permis de localiser les allèles porteurs de maladie et d’effectuer un diagnostic prénatal non invasif en utilisant la méthode indirecte (analyse de ségrégation de marqueurs situés sur le chromosome 7).

Ces résultats ont démontré la faisabilité de l’application de la méthode ISET au diagnostic prénatal non invasif et précoce de la Mucoviscidose, et ont suggéré l’opportunité de développer un protocole de validation clinique. Ce protocole, réalisé en collaboration avec les équipes du Prof. Munnich (Dr Bonnefont), Prof. Dumez (Dr Benachi) et défini par le Dr Jaïs et le Prof Thalabar. a commencé en 2006 et a été terminé avec succès en 2009.

L'analyse de la mutation spécifique caractérisant la Mucoviscidose (délétion de 3 nucléotides au codon 508), a été réalisée en aveugle dans notre laboratoire (Biochimie A et INSERM U807) sur l’ADN des CFTCs et dans le laboratoire de Génétique Médicale de l’Hôpital Necker sur le prélèvement des villosités choriales (méthode invasive). Les génomes de cellules uniques identifiés d’origine foetale par la présence de l’allèle maternel et paternel avec les marqueurs STR informatifs, et l’ADN extrait à partir du sang du père et de la mère, ont été amplifiés avec des amorces spécifiques du locus F508 du gène CFTR ( Saker et al, 2006).

Dans 9 cas sur 16, l’ADN du cas index était disponible, ce qui a permis d’effectuer le

diagnostic non invasif également par la méthode indirecte (par l’utilisation de marqueurs STR sur le chromosome 5) (pour détails sur le principe de cette méthode voir Saker et al, Pren Diagn, 2006).

Ayant terminé l’étude du sang des 16 mères à risque et ayant analysé 10 CFTCs par mère, nous avons organisé, en janvier 2009, la réunion d’ouverture de l’aveugle avec Dr. Bonnefont et le Dr Benachi. Couple par couple, nous avons montré les résultats et énoncé le diagnostic obtenu avec la méthode ISET. Le Dr. Bonnefont nous a ensuite communiqué le diagnostic obtenu par la méthode invasive : dans tous les cas notre diagnostic était exact. Le Dr.Bonnefont et le Dr Benachi ont ensuite signé le document qui atteste la validation de la méthode ISET pour le DPN non invasif de la Mucoviscidose.

Nos résultats prouvent que l'approche ISET est une approche fiable pour le DPN non invasif de la Mucoviscidose. Nous remercions l’Association ABCF Mucoviscidose pour avoir rendu possible cet avancement important dans le DPN de la Mucoviscidose.

Projet financé par Mucoviscidose : ABCF

 

Bibliographie

G. Vona, C. Béroud, A. Benachi, A. Quenette, J.P. Bonnefont, Y. Dumez, B. Lacour, P. Paterlini-Bréchot. Enrichment and genetic analyses of fetal cells circulating in the maternal blood by the ISET technique and single cell microdissection : a non-invasive tool for early prenatal diagnosis. Am J Pathol. 2002, 160: 51-58.

Béroud C, Karliova M, Bonnefont JP, Benachi A, Munnich A, Dumez Y, Lacour B, Paterlini-Bréchot P. Prenatal diagnosis of Spinal Muscular Atrophy (SMA) by genetic analysis of circulating fetal cells. The Lancet, 2003, 361: 1013-4.

Saker A, Benachi A, Bonnefont JP, Munnich A, Dumez Y, Lacour B, Paterlini-Bréchot P Genetic characterization of circulating fetal cells allows non invasive prenatal diagnosis of Cystic Fibrosis, Prenat Diagn. 2006, 26: 906-916.

Mouawia H, Bonnefont JP, Benachi A, Jaïs JP, Paterlini-Brechot P Clinical validation of a non-invasive strategy for prenatal diagnosis of Spinal Muscular Atrophy (SMA) and Cystic Fibrosis (CF) (submitted for publication)